根据特殊饮食史及同餐者发病情况，结合临床表现咽干、便秘、视力模糊和中枢神经系统损害等症状和体征，一般不难作出诊断，检出细菌仅能作为辅助依据，其目的在于通过培养检出毒素而获确诊。婴儿肉毒中毒的确诊主要依据检测患儿粪便中肉毒梭菌或肉毒梭菌毒素，因血中毒素可能已被结合而不易检出。创伤性肉毒中毒，主要检测伤口肉毒梭菌或血清中毒素。
实验室检查：
1.病原学检查将可疑食物、呕吐物或排泄物加热煮沸20min后，接种血琼脂作厌氧菌培养，检出致病菌。
2.毒素试验
(1)动物试验：将检查标本浸出液饲喂动物，或作豚鼠、小白鼠腹腔内注射，同时设对照组，以加热80℃30min处理的标本或加注混合型肉毒抗毒素于标本中，如试验组动物发生肢体麻痹死亡，而对照组无，则本病的诊断即可成立。
(2)中和试验：将各型抗毒素血清0.5ml注射小白鼠腹腔内，随后接种标本0.5ml，同时设对照组，从而判断毒素和定型。
(3)禽眼接种试验：将含有毒素的浸出液，视禽类大小，采用0.1～0.3ml不等注入家禽眼内角下方眼睑皮下，出现眼睑闭合，或出现麻痹性瘫痪和呼吸困难，经数十分钟至数小时死亡，可作为快速诊断。
其他辅助检查：肌电图检查有肌纤维颤动，单次刺激反应降低，多次反复刺激电势反而增高，有短持续期小波幅多相运动、电势增加等特点，有助于本病诊断。